1. Introducción

La esterilización es el proceso de conseguir la esterilidad, en la que no existen grados; un objeto, superficie o substancia es, o no es, estéril. Si es estéril no contiene organismos viables o células presentes y si se le protege contra la contaminación, la condición estéril permanecerá indefinidamente. La desinfección implica que el material ha sido tratado a fin de eliminar o reducir el riesgo de organismos patógenos, pero no implica que todos los organismos viables hayan sido inactivados Los procedimientos de esterilización son aplicados para:

(1) asegurar que un proceso o experimento sea llevado a cabo solamente con el organismo deseado,
(2) permitir la utilización segura de los productos,
(3) evitar contaminación ambiental,
(4) impedir la deterioración de un producto.

La esterilización se lleva a cabo o bien eliminando los organismos viables, como en la filtración, o matándolos de una de las siguientes formas:

(1) calentando en presencia o ausencia de agua,
(2) irradiando con radiaciones ultravioleta, gamma o rayos X,
(3) tratando con productos químicos en solución o en forma gaseosa.

La elección del agente depende de las circunstancias, servicios existentes, naturaleza del material o equipo que ha de ser esterilizado, y coste.

2. Resistencia a la esterilización

Las esporas bacterianas son las células vivas conocidas más resistentes al calor y la esterilización debe ser capaz de eliminar las esporas más resistentes de las especies más resistentes. Se ha descrito que las esporas de las bacterias termófilas sobreviven el vapor de agua a presión (200 kPa o 30 psi) a 134 °C durante entre 1 y 10 minutos, y el calor seco a 180 °C durante al menos 15 minutos. La resistencia de las esporas individuales dentro de una población varía, y cuanto mayor sea la población, mayor es el número de esporas individuales más resistentes. La resistencia de las esporas será afectada también por las condiciones de esporulación, condiciones de almacenamiento y edad, así como por las condiciones durante y después del calentamiento. El organismo más resistente a radiaciones es Deinococcus (= Micrococcus) radiodurans que se ha encontrado que sobrevive a dosis tan altas como 6.000 krad.

3. Mecanismos de muerte

3.1. Calentamiento

La muerte de una espora es necesaria solamente para desnaturalizar irreversiblemente todas las moléculas de cualquier enzima que sea esencial para la germinación o el crecimiento, o alternativamente para dañar irreversiblemente el gen para una enzima esencial. El calentamiento causa la ruptura del DNA pero la asociación protectiva entre el DNA y el dipicolinato cálcico de la espora bacteriana hace más probable que el daño letal en la esterilización por calor implique la inactivación de proteínas. La resistencia de las proteínas al calor es una función de su hidratación, y cuanto mayor sea la cantidad de agua, más fácilmente entrará en los dominios hidrofóbicos internos de las moléculas de proteínas causando un cambio irreversible en su conformación. Las estimaciones del contenido en agua de las esporas han variado en el rango de aproximadamente 5-20 %.

En la esterilización húmeda el vapor a presión tiene dos funciones importantes:

(1) condensándose sobre el material que va a ser esterilizado permite que el calor se transfiera rápidamente causando un aumento rápido de la temperatura;

(2) las propias moléculas de agua aumentan, o al menos mantienen el nivel de hidratación dentro de la espora.

En la esterilización con calor seco el calor es transferido muy lentamente y la tendencia es reducir más el nivel de hidratación y de esta forma proteger las proteínas de las esporas; las esporas son considerablemente más resistentes al calor seco que al calor húmedo.

3.2. Radiación

La irradiación mediante luz ultravioleta de longitud de onda 250-280 nm conduce a un daño en el DNA que es proporcional a la dosis de radiación. El daño principal es la formación de dímeros de pirimidinas entre bases adyacentes; los mecanismos de reparación son capaces de restablecer la integridad del DNA pero es improbable que funcionen en una espora durmiente. La radiación ultravioleta no es muy penetrante y no se puede confiar en ella como agente esterilizante, a menos que se pueda garantizar la exposición directa del organismo contaminante.

Los rayos gamma y los rayos X son más útiles debido a su alto poder de penetración. Existen dos clases principales de efectos:

(1) se produce un gran número de rupturas de cadenas sencillas y de la doble cadena del DNA;

(2) muchas moléculas dentro de la célula son ionizadas dando lugar a formas tóxicas altamente reactivas, como peróxidos y radicales libres, a los que los grupos -SH de las enzimas son particularmente susceptibles.

3.3. Agentes químicos

Los agentes químicos esterilizantes pueden matar como resultado de su capacidad de oxidar o alquilar. Muchos son también tóxicos para el hombre, o carcinogénicos, y puede requerirse un equipo especial para su uso. Por ejemplo, el óxido de etileno es violentamente explosivo en mezclas con el aire, es crónicamente tóxico a concentraciones no detectadas por el olfato y puede producir hipersensibilización de la piel, eritema y edema.

4. Determinación de la destrucción de los microorganismos

Para matar organismos, cualquiera que sea el método, se requerirá una dosis letal, que dependerá de la duración del tratamiento nocivo. Por tanto, en los procesos de calentamiento, la relación temperatura/tiempo será lo más importante, en la radiación la energía de transmisión/tiempo y en la esterilización por agentes químicos, la relación concentración/tiempo. En todos los casos otros factores alterarán estas relaciones, por ejemplo la presencia de agua, de oxígeno u otros gases o agentes protectores como proteína, temperatura, etc. Cualquier dato sobre mortalidad debe incluir las condiciones experimentales, y en particular, puesto que el tamaño de la población determinará la consecución del proceso de esterilización, siempre debe indicarse el nivel inicial de contaminación.

Debido a dificultades experimentales en determinar los tiempos de muerte, puede encontrarse en la literatura una amplia variedad de valores para supuestamente la misma cepa u organismo.

4.1. Definiciones

El tiempo térmico letal (el tiempo más corto que lleva destruir los microorganismos a una temperatura determinada) y el punto térmico letal (la temperatura más baja que se necesita para matar a los organismos en 10 minutos) son frecuentemente citados, pero a menos que sean conocidos el tamaño inicial de la población y las condiciones precisas, no son particularmente útiles. Un parámetro más útil es el tiempo de reducción decimal o valor D, tiempo (en minutos, a una temperatura determinada) que se requiere para reducir la población viable al 10% de su valor previo. El valor-Z es el cambio de temperatura que se requiere para modificar el valor D por un factor de 10.

4.2. Cinética de muerte

Bajo condiciones letales, los organismos de una población no mueren sincrónicamente. Estadísticamente la inactivación durante un período finito (es decir a medida que la dosis letal aumenta) es proporcional al número de células viables al principio del período, es decir, la población muere exponencialmente. Por tanto una gráfica del logaritmo del número de supervivientes a cualquier tiempo (dosis) durante el tratamiento contra el tiempo transcurrido de tratamiento (dosis), producirá una línea recta. Cuando el descenso logarítmico es constante desde el tiempo cero, la curva es una forma de cinética de «choque único» (es decir, una lesión irreversible es suficiente para matar a una célula) y se describe mediante la ecuación:

N/No = e exp-kd (1)

donde No = población inicial, N = número de supervivientes después de la dosis o tiempo de tratamiento, d = dosis o tiempo de tratamiento y k = velocidad constante de muerte específica.

No todas las poblaciones exhiben cinética de «choque único» pudiendo encontrar una curva con un hombro antes del comienzo de la inactivación logarítmica, en cuyo caso las cinéticas de supervivencia son de la forma

N/No = 1-(1-e exp-kd)expn (2)

donde n es un número de extrapolación igual a la intersección sobre el eje N/No que da el número de «choques» requeridos para la letalidad. O bien existe un requerimiento de choques múltiples para letalidad o alternativamente, cada «unidad» viable puede consistir en varias células o esporas diferentes y la inactivación de la unidad no se observa hasta que cada componente sea inactivado. (En la práctica también se encuentran curvas de supervivientes no lineales).

El valor D también se obtiene por interpolación como el tiempo transcurrido durante cualquier unidad de reducción logarítmica de los supervivientes sobre la parte recta de la gráfica. Cuando los logaritmos de los valores D a diferentes temperaturas se trazan frente a la temperatura, se encuentra que la relación es generalmente una Iínea recta de la cual puede ser obtenido directamente el valor z por interpolación.

Mientras los valores D son muy dependientes de las condiciones, tanto de tratamiento como de recuperación, los valores z son bastante menos dependientes de estos factores. Los valores z pueden ser importantes para determinar los límites de un proceso ya que los materiales pueden ser incapaces de soportar ciertas temperaturas. Sin embargo, los valores z no pueden ser verdaderamente constantes a lo largo de un amplio rango de temperatura, ya que por debajo de una temperatura particular no ocurrirá ningún daño y el valor D sería infinito.

5. Determinación de las condiciones de esterilización

La dosis de esterilización requerida dependerá del nivel inicial de contaminación. Para una población que exhiba curvas de «choque único» a varias temperaturas o dosis de radiación, para cualquier número de esporas en la población, inicialmente el cálculo de las condiciones del proceso que se requieren para cualquier grado de probabilidad de éxito en la esterilización se realiza fácilmente. Por ejemplo para una población contaminante de 10 exp8 organismos, la aplicación de 8 valores D de tiempo de procesamiento a una temperatura determinada reduciría el logaritmo del número de supervivientes a cero, es decir, a un organismo, y asumiendo un descenso logarítmico continuo en la población, un valor D adicional de tiempo de procesamiento representaría la probabilidad de 1 en 10 de encontrar un superviviente, es decir, de no esterilizar.

5.1. Unidad de letalidad

Para comparar las capacidades relativas de esterilización de los diferentes procesos de calentamiento se requiere una unidad de letalidad. La unidad escogida es el efecto letal de un minuto de calentamiento a la temperatura de 121 °C. La letalidad relativa puede ser expresada en términos de valores F basados en la relación:

F = t x 10 exp(T -121)/z (3)

donde t = tiempo de aplicación del tratamiento letal, T = temperatura en °C y z = aumento de temperatura requerido para reducir el período de calentamiento en un 90 %(es decir el valor z ).

En el caso modelo t = 1 minuto de calentamiento y T = 121°C de forma que F = 1. En casos prácticos, puesto que la resistencia relativa de los organismos a diferentes temperaturas varía, debería ser empleado el valor z de los contaminantes más resistentes a la temperatura. Las esporas más resistentes al calor que se encuentran normalmente, tienen un valor z de 10 °C y este valor puede ser utilizado si no se pueden llevar a cabo experimentos específicos. Utilizando z = 10 el valor patrón de F se denomina Fo a la temperatura de 121 °C.

Si a un proceso se le asigna el valor de F = 4, este proceso produciría una muerte equivalente a la de 4 minutos de tratamiento control. Si tales procesos fueran aplicados a un organismo modelo cuyo valor D fuera de 2,0 minutos, la reducción de viabilidad sería de 100 veces. La muerte esperada para cualquier población inicial contaminante en la que se conocen el valor D para el organismo y F para el proceso, se puede obtener a partir de la ecuación:

F s = D (log N o - log N ) (4)

en la que F s es la capacidad letal integrada del calor recibido por todos los puntos en el material calentado durante el proceso de calentamiento. Correspondientemente si se conocen las cuentas viables inicial y final puede definirse F s para el proceso.

Para medios de fermentación una probabilidad aceptable de fallo en la esterilización puede ser de 0,001 (1 fallo de cada 1.000 preparaciones). Si por ejemplo va a realizarse la esterilización de 100 litros de líquido de maceración de maíz y el nivel de contaminación es de 10 e6 esporas viables por ml, la contaminación biológica total será de 10 e11 esporas. Si la temperatura de procesamiento es de 121 °C y el valor D de las esporas del Bacillus contaminante a esta temperatura es de 3 min entonces, con cinética de «choque único» el tiempo de procesamiento requerido (utilizando la ecuación 4) para tener una probabilidad de fallo de 0,001 es de un total de 14 x D = 42 minutos. (Si la curva de muerte es de «choque múltiple» debe añadirse el tiempo correspondiente al hombro).

Si por alguna razón, por ejemplo la destrucción de un componente nutricional, no es posible utilizar esta combinación de tiempo/temperatura, será posible encontrar un nuevo tiempo de procesamiento a partir de la ecuación:

t = 42 x 10(121-T )/z (c.f Ecuación 3)

Si se está utilizando el organismo modelo y la nueva temperatura es 131 °C, entonces con F = 1,0 y z = 10 el nuevo tiempo de procesamiento sería t = 42 x 10 exp-1= =4,2 min. En otras palabras si se eleva la temperatura de esterilización en 10 °C, el tiempo de calentamiento debería disminuirse en 10 veces. Sin embargo, si el organismo contaminante más resistente es mucho menos resistente que el organismo resistente modelo, con un valor D de por ejemplo 1,2 min a 121 °C, entonces para llevar a cabo la letalidad equivalente a 121 °C, de la ecuación 4.

F s = 1,2 (log 10 exp11 - log 10 exp-3) = 16,8 min

Si se fueran a esterilizar los 100 litros de medio mediante un cambiador de calor de flujo continuo con una capacidad de 10 litros y se mantiene la temperatura a 131 °C, la contaminación total para 10 litros es 10 exp10 . El equivalente F s para el proceso se convierte en 1,2 x 13 = 15,6 min, y el tiempo de residencia (t r) durante el que se va a mantener la temperatura de 131 °C será de:

t r = 1,56 min

Asumiendo un flujo de pistón perfecto y un calentamiento a la entrada y un enfriamiento a la salida instantáneos, la velocidad requerida de flujo del medio será de 10/1,56 = 6,4 litros/min-1. La ventaja práctica de utilizar procesos rápidos a alta temperatura en la esterilización es que las energías de activación para la destrucción térmica de muchos componentes de interés varía entre 10 y 25 Kcal/mol y los coeficientes de temperatura para tales reacciones son menores que para la esterilización.

En la industria alimentaria el peligro más serio para la salud es la presencia de Clostridium botulinum, el formador de esporas patogénico más resistente al calor, así como el agente más tóxico. Los valores D de las esporas a 121 °C son del orden de 0,2 min. Debido a que se pensaba que los alimentos no procesados utilizados en la industria conservera podían contener el equivalente a una espora de Cl. botulinum por gramo y a que una gran industria puede procesar, digamos, 10 exp11 g por año, fue considerada razonable una protección del orden de 12 x D por lote tratado. Redondeando hacia arriba se consideró un procesamiento de 3 min a 121 °C el tratamiento control. En la práctica los niveles de contaminación son más probablemente de 10 exp-3 a 10 exp-4 esporas de C. botulinum por gramo y con la excepción de uno o dos episodios notables, la industria conservera ha tenido un historial notablemente bueno.

En los procesos de esterilización clínica en los que la carga biológica en un lote individual de, digamos, vendas contaminadas puede ser muy considerable las relaciones tiempo-temperatura de esterilización son:

Para calor húmedo: Para calor seco:

vapor 134 °C (207 kPa, 30 p.s.i.) 3 min 160 °C 45 min
vapor 126 °C (138 kPa, 20 p.s.i.) 10 min 170 °C 18 min
vapor 121 °C (103 kPa, 15 p.s.i.) 15 min 180 °C 71/2 min
vapor 115 °C (69 kPa, 10 p.s.i.) 20 min

Sobre estas bases un tiempo de mantenimiento de 15 min de vapor a 121 °C equivale a 75 x D, lo que hace la probabilidad de fallo en relación a la supervivencia de C. botulinum casi imposiblemente remota.

5.2. «Tiempo de tratamiento» y «Ciclo de tiempo»

Independientemente de lo grandes que sean los volúmenes de líquido (e incluso más los de sólidos) que hayan de ser esterilizados, los tiempos de calentamiento y de enfriamiento se vuelven apreciables y ocupan la mayor proporción del tiempo del ciclo. Esto sucede incluso para lotes de medio a escala de laboratorio. Estos datos muestran claramente que con un tiempo establecido de 10 min, el tiempo de calentamiento era casi dos veces más largo para las unidades de volúmenes más pequeños y 6 veces mayores para las unidades de volúmenes más grandes.

El calentamiento discontinuo de los volúmenes que se necesitan a escala industrial implicará tiempos considerablemente más largos de calentamiento y enfriamiento antes de que se pueda llevar a cabo la inoculación. Durante tales ciclos los efectos letales se extienden a lo largo de un rango mucho más amplio del ciclo que el tiempo real de mantenimiento y es necesario integrar el efecto letal sobre el programa conjunto tiempo-temperatura si se desea evitar el grave deterioro del medio. La determinación de los efectos letales integrados en un gran contenedor cuyo contenido no sea calentado homogéneamente es un proceso complejo. Una práctica sencilla es medir la temperatura (mediante un termosensor) en el punto más impenetrable al calor, tomar nota de su variación con el tiempo, representar esta relación sobre papel gráfico de «letalidad» y obtener la letalidad total integrada (valor F del ciclo a partir del área bajo la curva. El papel de letalidad tiene una abscisa de tiempos y en ordenadas están marcadas las temperaturas, pero la escala está en unidades relativas de letalidad. Tomando como unidad los efectos letales de 1 min a 121 °C, 1 min a 111 °C es 0,1 unidades, ya que D es 10 veces mayor (1/10 del efecto de muerte) para una caída de 10 °C siendo z = 10 °C (el valor control aplicado normalmente); similarmente 1 min a 101 °C es 0,001 unidades.

6. Métodos prácticos

6.1. Calentamiento

La esterilización puede ser en lotes o continua. Para la esterilización por calor el vapor debería estar siempre saturado, de forma que una pequeña bajada en la temperatura (por contacto con material más frío) cause la liberación de vapor de condensación.

Procesos discontinuos

(a) Autoclaves. Estos son vasijas relativamente pequeñas para la esterilización por vapor de volúmenes de hasta unas decenas de litros, para fermentación a escala de laboratorio y para la esterilización de fermentadores pequeños, y (por extensión) para ciertos productos estériles en la industria. Los autoclaves son controlados normalmente mediante manómetros y termómetros y ambos deben ser controlados. Todo el aire debe ser eliminado antes del ciclo de calentamiento, ya que mezclas de aire y vapor a una presión determinada alcanzarán una temperatura más baja que la del vapor puro a la misma presión.

Al final del tiempo de mantenimiento debe permitirse un tiempo adecuado de enfriamiento durante el que la presión debe descender lentamente. La liberación brusca de la presión causa roturas o violento burbujeo y derrame del contenido al hervir. Cuando se carguen montajes, como fermentadores, se debe tener cuidado acerca del estado de las válvulas y los cierres para permitir el acceso del vapor a los recipientes.

(b) Inyección directa del vapor. Un fermentador grande tiene generalmente adaptadas las tuberías y las válvulas necesarias para la esterilización de la vasija y de las tuberías de alimentación asociadas mediante inyección directa del vapor. En algunos casos puede añadirse al fermentador ya estéril el medio esterilizado separadamente, pero también es posible esterilizar el lote de medio in situ. Si se utilizan inyecciones directas de vapor se debe tener en cuenta el hecho de que entre 10 y 20 % del volumen final serán debidos a condensación.

Mientras la eficiencia térmica de este proceso es alta, la fuerte formación de espuma durante el burbujeo puede limitar la transferencia del calor. Asimismo muchos medios de fermentación pasan a través de una fase de alta viscosidad durante el calentamiento, particularmente en medios ricos en almidón. También se produce la formación de grumos sólidos a partir de «papillas» y el centro de tales grumos puede no alcanzar nunca una dosis letal total adecuada. Para minimizar estos problemas debe tenerse el cuidado adecuado en los lotes de mezclar y agitar los constituyentes durante la preparación y esterilización del medio.

Otras causas de fallo en la esterilización pueden deberse al mal diseño de ingeniería cuando los orificios de inserción de los termómetros, las uniones, las aberturas de muestreo etc., producen grietas o cavidades en la que los agregados sólidos resisten los procedimientos subsiguientes de limpieza y esterilización.

(c) Calentamiento indirecto. Este se lleva a cabo indirectamente pasando vapor de agua a través de una espiral de intercambio de calor o de una camisa. En vasijas encamisadas el área que existe de transferencia de calor dependerá del diámetro del tanque y cuanto más grande sea la vasija más lenta será la velocidad de calentamiento. Para sistemas con espirales internos la relación área/volumen puede permanecer más o menos constante cualquiera que sea el tamaño del reactor. El calor en este procedimiento es menos eficiente que por inyección directa y en ambos casos permanecen los problemas de enfriamiento, generalmente conseguido mediante espirales.

Deben tenerse en cuenta las reacciones no deseadas debidas al calentamiento. Es común entre ellas la oxidación de los fenoles y la reacción de Maillard, entre los azúcares reductores y los grupos amino (aminoácidos y proteínas) que originan productos de condensación, que puede inactivar gran parte de los carbohidratos y del nitrógeno aminado. Estas reacciones se ven favorecidas a pH alcalino. Sin embargo, parte de la «cocción» puede también aumentar el valor nutricional de un medio. Dependiendo de los procedimientos disponibles puede ser posible esterilizar los ingredientes por separado y mezclarlos asépticamente y esto se hace frecuentemente en trabajo a escala de laboratorio. La esterilización generalmente causa una variación del pH, generalmente hacia pH más acido y es común el reajuste después de la esterilización.

Esterilización por flujo continuo

Estos procesos tienen la ventaja de que son rápidos, ahorran espacio de planta (comparados con un esterilizador en lotes independiente) y debido al corto tiempo de los procesos mejoran la calidad del medio. En el diseño del equipo deberían considerarse las tres etapas del ciclo a fin de conseguir:

(1) un rápido calentamiento
(2) un tiempo de mantenimiento a la temperatura de esterilización
(3) un rápido enfriamiento

Inyección directa del vapor

Como los procesos discontinuos, este ofrece una alta eficiencia de transmisión del calor y bajo coste de capital. El vapor se inyecta directamente en el medio que fluye a través de un mezclador de tipo Venturi y el flujo se mantiene a la temperatura de esterilización (digamos 140 °C) en una espiral perfectamente aislada térmicamente, en la que el tiempo de residencia determina el valor F de tratamiento. Luego se pasa directamente a una refrigeración rápida. El enfriamiento más rápido se consigue por evaporación instantánea: el fluido desde la espiral de mantenimiento pasa a través de una válvula de entrada a una cámara de expansión en la que la rápida caída de la presión causa la vaporización del vapor y la temperatura baja a aproximadamente 100 °C. Una desventaja es el exceso de espuma que se origina. Alternativamente (o adicionalmente) el enfriamiento puede llevarse a cabo en un cambiador de calor utilizando el medio frío que entra como un absorbente de calor, con un ahorro considerable de energía. El enfriamiento hasta la temperatura de inoculación puede ser completado mediante un cambiador de calor enfriado por agua.

Calentamiento indirecto por vapor

Para el calentamiento rápido puede utilizarse una placa cambiadora de calor a través de la que se pasa vapor a 500-690 kPa (80-100 p.s.). El área de cambio de calor puede ser considerable, comparada con el volumen que contiene, y el uso de materiales, como titanio ha permitido crear un eficiente equipo, fuerte, ligero y anticorrosivo. La limpieza y el montaje pueden también llevarse a cabo fácilmente con estas unidades; no se introduce ninguna condensación y las impurezas presentes en el vapor no entran en el medio. El mantenimiento y el enfriamiento se pueden llevar a cabo como anteriormente.

Con ambos tipos de esterilizadores el calentamiento producirá la coagulación de las proteínas del medio y el material insoluble puede causar problemas adhiriéndose a las superficies. El vapor conducido por tuberías también se utiliza para la esterilización directa (en línea) de válvulas, cierres y puertas de muestreo, así como de filtros de aire. Los requerimientos de diseño para estos son críticos, particularmente en plantas a escala industrial.

Esterilización por calor seco

La esterilización por calor seco se lleva a cabo en hornos provistos de ventiladores para la circulación del aire caliente. La forma de empaquetar el horno es de gran importancia ya que la transferencia del calor desde el aire seco es muy baja. Puede solamente utilizarse para materiales sólidos, como material de vidrio del laboratorio, talco, etc., capaces de soportar las altas temperaturas que se necesitan. Para seguir la velocidad de calentamiento se emplearán termosensores.
 

                             Portada  Sala de despiece  Fabrica de embutidos  Aves y huevos  Formulario   Consejos    Calorias